肿瘤类器官（PDOs）：主要是由肿瘤组织细胞、肿瘤干细胞或肿瘤特异性细胞在特殊的培养微环境下形成具有与实体肿瘤类似的组织结构和功能的三维细胞集合体，包含自我更新和分化能力的干细胞，拥有原发肿瘤的基因谱系和病理特征，是肿瘤研究的新型体外模型。

1. 细胞分盘:通过胰酶消化收集细胞，将细胞种于60mm培养皿（根据实验需求）。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的50％以上时进行转染；

2. 混匀核心质粒和包装质粒:取两个无菌1.5ml EP管，一个EP管中加入200µl无血清DMEM，加入1.5µg核心质粒和1.5µg病毒包装质粒；另一个EP管中加入200µl无血清DMEM，加入6µl lipo2000，静止5分钟。然后将两管充分混匀，静置15-20min；

3. 孵育:将这400μl的混合液逐滴加入细胞培养皿中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO2的37℃温箱孵育；

4. 换液：10h-16h后吸去培养基，加入适量37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育；

5. 收集病毒上清:转染后24h、48h左右收集含慢病毒的上清。1500rpm离心五分钟，或者使用0.45um滤器过滤后分装冻存于-80℃，避免反复冻融。

1. 小心吸出孔中的类器官培养基，PBS清洗2遍，每孔加入1ml 类器官传代消化液，用移液枪吹散基质胶，转移到15ml离心管中；

2. 将离心管置于摇床室温孵育10~15min；

3. 加入10ml预冷addDMEM/F12+++重悬，300g 4℃离心5min；

4. 去除上清，加入10ml预冷addDMEM/F12+++重悬，300g 4℃离心5min；

5. 去除上清，加入类器官培养基重悬，慢病毒与重悬液以1:5的体积加入重悬混合，37℃培养箱孵育1~2 h；

6. 300g 4℃离心5min，去除上清；

7. 加入相应体积的类器官培养基与基质胶1:1重悬，从37℃培养箱中取出提前2h放入的24孔板，每孔加入50ul混合液，放入37℃培养箱5min后倒置凝固20min；

8. 凝固后加入500ul类器官培养基到24孔板，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，以及荧光情况，每隔2~3d更换培养液。